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面包 /L以上,最高可达513mg/ml,明显优于单倍体菌株的253mg/ml 因此二倍体菌株具有明显的表达量优势


经测序鉴定正确的二倍体阳性克隆命名为MFD5 而单倍体菌株GS115_AlbA无Zeocin抗性基因，因此无法在含有Zeocin的培养基中生长 首先将上述两种单倍体菌株涂于Yro固体培养基上活化
首先将上述两种单倍体菌株涂于YH)固体培养基上活化 将活化的两种单倍体缺陷型菌株于含有Zeocin和G418抗生素的YPD固体培养基上相互垂直交叉划线，置于30°C培养至两种单倍体菌株交叉点长出单克隆
挑取单克隆划线到新的含有Zeocin和G418抗生素的固体培养基上30°C扩增培养 挑取单菌落进行显微镜观察并于单倍体菌落培养物进行比较，以确定形成二倍体菌株，其中二倍体菌落的形态明显大于单倍体菌落
由于X33-AlbZ (ZeocinK)同时含有Zeocin基因，因此在扩增培养时使用含有G418和Zeocin双抗的MD平板进行筛选，以减少出现的假阳性 实施例8: 二倍体菌株摇瓶表达 为了验证二倍体菌株的重组人血白蛋白表达量比单倍体菌株高，将实施例7制备得到的七株二倍体菌株MFD1-7、单倍体对照菌GSl 15-AlbN及阴性对照菌株GSl 15在摇瓶上进行初步表达研究
将活化的两种单倍体菌株在含有Zeocin的MD固体培养基上相互垂直交叉划线，置于30°C培养至两种单倍体菌株交叉点长出单克隆 挑取单克隆`划线到新的含有Zeocin的MD固体培养基上30°C扩增培养 经测序鉴定正确的二倍体阳性克隆命名为MFD6
将菌液3000rpm离心5min收集细胞，去除上清液，用BMMY培养基(1%酵母粉，2%蛋白胨，IOOmM磷酸钾pH6.0, 1.34%ΥΝΒ4Χ 10、生物素，0.5%甲醇)重悬菌体，进行诱导表达 每24h加入终浓度1.5%的甲醇继续诱导 诱导至第5天(120h)结束培养 将发酵液12000rpm离心5min后收集上清液进行HPLC表达量分析 HPLC分析采用TosohG3000SWXL，流动相为含1%异丙醇的pH7.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.6ml/min，检测波长为280nm